توسط HPLC (کروماتوگرافی با کارایی بالا)………………………………………………………………………………………..۳۷
۲-۸ کروماتوگرافی گازی-اسپکترومتری جرمی; روشی برای تعیین علف کش پاراکوات و

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

دی کوات در نمونه های پلاسما و ادرار…………………………………………………………………………………………………۳۷
۲-۹ تعیین پاراکوات در نمونه های بیولوژیک توسط روش ساده شده
استخراج فاز جامد و اسپکتروفوتومتری………………………………………………………………………………………………..۳۸
۲-۱۰ تخمین اورژانسی پاراکوات در پلاسما ،مقایسه روش RIA (رادیوایمونو اسی )و
روش رنگ سنجی جفت یونی………………………………………………………………………………………………………………۳۸
۲-۱۱ یک روش ساده و مختصر برای تعیین پاراکوات در پلاسما …………………………………………………….۳۸
۲-۱۲مقایسه روش شناسایی پاراکوات در خون توسط زئولیت با روش معمول شناسائی
پاراکوآت در ادرار………………………………………………………………………………………………………………………………..۳۹
۲-۱۳ نمای شماتیک استخراج یک کاتیون توسط یک رزین تبادل کاتیونی…………………………………۴۰
فصل سوم (مواد و دستگاه های مورد نیاز و روش های پژوهش)
۳-۱ وسایل و دستگاه های مورد نیاز………………………………………………………………………………………………….۴۲
۳-۲ مواد……………………………………………………………………………………………………………………………………………..۴۲
۳-۳ خلاصه روش اجرای آزمایش………………………………………………………………………………………………………۴۳
۳-۴ تهیه پودر میکرونیزه کلینوپتیلولایت…………………………………………………………………………………………..۴۳
۳-۵ روش کلی انجام آزمایش……………………………………………………………………………………………………………..۴۳
۳-۶ مشخصات ابزار جمع آوری اطلاعات و نحوه جمع آوری آن……………………………………………………….۴۵
۳-۷ روش محاسبه حجم نمونه و تعداد آن…………………………………………………………………………………………۴۵
۳-۸ روش محاسبه Limit Of Detection ((LOD…………………………………………………………………….45
۳-۹ روش محاسبه Limit Of Quantification((LOQ……………………………………………………………45
۳-۱۰ روش محاسبه خطای درون آزمایش یا (Within-Run Erorr)WRE……………………………..45
۳-۱۱ روش محاسبه درصد بازیابی(Recovery)……………………………………………………………………………..46
۳-۱۲روش کار……………………………………………………………………………………………………………………………………..۴۵
۳-۱۳ طریقه ساخت محلول stock…………………………………………………………………………………………………..46
۳-۱۴انواع آزمایشات……………………………………………………………………………………………………………………………۴۶
۳-۱۵رسم منحنی استاندارد پاراکوات دی کلراید در آب…………………………………………………………………..۴۷
۳-۱۶رسم منحنی استانداردپاراکوات دی کلراید بعد
ازمشتق سازی با معرف دی تیونیت سدیم۰٫۱% در سود ۱مولار………………………………………………………۴۸
۳-۱۷ اندازه گیری پاراکوات در خون بدون استخراج…………………………………………………………………………۴۹
۳-۱۸ استخراج پاراکوات از محلول آبی با بهره گرفتن از رزین
تبادل کاتیونی پروپیل کربوکسیلیک اسید(PCA)………………………………………………………………………….50
۳-۱۹ استخراج پاراکوات از محلول آبی با بهره گرفتن از کلینوپتیلولایت………………………………………………۵۱
۳-۲۰ ستخراج پاراکوات از خون با بهره گرفتن از رزین PCA………………………………………………………………52
۳-۲۱ استخراج پاراکوات از خون با بهره گرفتن از زئولیت کلینوپتیلولایت…………………………………………….۵۳
۳-۲۲ اندازه گیری پاراکوات در پلاسما به روش معمول……………………………………………………………………۵۴
۳-۲۳ مشتق سازی بیشتر:…………………………………………………………………………………………………………………۵۵
۳-۲۴ استفاده از حلالهای مختلف جهت استخراج پاراکوات از خون………………………………………………..۵۵
فصل چهارم ) نتایج(
۴-۱ طیف ماوراء بنفش پاراکوآت با غلظت ۱۰ μg/ml در آب مقطر………………………………………………۵۸
۴-۲ منحنی کالیبراسیون پاراکوات در آب مقطر
بعد از مشتق سازی با معرف دی تیونیت سدیم…………………………………………………………………………………۵۹
۴-۳ طیف مرئی پاراکوآت با غلظت ۱۰ μg/ml در معرف دی تیونیت سدیم…………………………………۶۰
۴- منحنی کالیبراسیون پاراکوات در سرم بعد از مشتق سازی با دی تیونیت سدیم در
طول موجnm 394.5…………………………………………………………………………………………………………………………….61
۴-۵ منحنی کالیبراسیون پاراکوات – دی تیونیت سدیم در طول موجnm603…………………………………62
۴-۶ طیف مرئی پاراکوآت با غلظت ۲ μg/ml بعد از

۵- قطع مرور زمان: وقتی مرور زمان شامل یکی از بدهکاران شود و آن بدهکار بری الذمه شود پس سایر بدهکاران نیز بری الذمه می شوند.
۶- اگر طلبکار از یکی از بدهکاران درخواست اجرای تعهد را بنماید و بدهکار تعهد را اجرا نکند، همه بدهکاران مسئول عدم این اجرا هستند.
در تضامن ناقص به دلیل وحدت موضوع، با پرداخت دین از سوی یکی از بدهکاران، دین سایر بدهکاران ساقط می شود، ولی اگر پرداخت کننده مسئول باشد و مدیون واقعی دین نباشد حق رجوع به مدیون را دارد برای مثال در بیمه خسارت، اگر خسارت ناشی از تقصیر ثالث باشد بیمه گذار حق رجوع به بیمه گر را دارد و بیمه گر پس از جبران خسارت می تواند آنچه پرداخت کرده را از ثالث (مقصر) مطالبه کند.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

سه: تعهدات تجزیه ناپذیر
تعهدات غیر قابل تجزیه از مواردی هستند که شخص ملزم به پرداخت دین دیگری می شود، از اینرو تعهدات تجزیه ناپذیر تعهداتی هستند که در آن چند متعهد وجود دارد. هر کدام از آنها صرفاً مدیون بخشی از آن دین هستند ولی به دلیل پیوستگی و غیر قابل تجزیه بودن تعهدات هر یک از آنها در مقابل طلبکار مسئول اجرای تمام تعهد می شوند.^[۲۹۴]
تجزیه ناپذیری تعهد به سه صورت ممکن است: یک- تجزیه ناپذیری طبیعی (مانند تعهد چند کفیل به حاضر کردن مدیون را دادگاه) دو- تجزیه ناپذیری قانونی؛ یعنی دو طرف قرارداد به صراحت یا ضمن پرداخت آن را تجزیه ناپذیر می دانند و یا اینکه قانون تجزیه تعهد را نپذیرفته است. سه- تجزیه ناپذیری قراردادی؛ مانند مواردی که در قرارداد قید مجتمعا می شود. ^[۲۹۵]
تعهدات تجزیه ناپذیر هم ، مانند تعهدات تضامنی^[۲۹۶] طلبکار می تواند نسبت به تمام طلب خود به هر یک از بدهکاران رجوع کند و بدهکار پرداخت کننده هم می تواند به بدهکاران دیگر رجوع کند.
بدهکار پرداخت کننده اگر مسئول باشد یا نسبت به قسمتی از دین بدهکار و نسبت به دیگری مسئول باشد، نسبت به قسمت اخیر الذکر در صورت پرداخت، جانشین طلبکار می شود و می تواند به سایر بدهکاران رجوع نماید.
چهار: مسئولیت ناشی از فعل غیر
مسئولیت ناشی از فعل غیر مثال آشکاری است مبنی بر اینکه شخص ملزم به پرداخت دین دیگری می شود. در این نوع مسئولیت فعل زیانبار توسط یک شخص انجام می شود، ولی شخص غیر از شخص مرتکب زیان باید جبران خسارت کند. مثالهای بارز مسئولیت ناشی از فعل غیر عبارتند از: ۱- مسئولیت کارفرما نسبت به فعل زیانبار کارگران خود (ماده ۱۲ ق.م.م.) مسئولیت سرپرست یا محافظ صغیر و مجنون (ماده ۷ ق.م.م.) مسئولیت دولت و شهرداری ها نسبت به اعمال کارکنان خود (ماده ۱۱ ق.م.م.) مسئولیت متصدی حمل و نقل نسبت به فعل زیانبار مأمور خود.
وجه اشتراک در همه مسئولیتهای فوق این است که شخص دیگری عامل ورود زیان را تحت هدایت و حمایت خود قرار می دهد. می توان از مثالهای فوق این نتیجه را به دست آورد که هر جا شخص تحت نظارت دیگری فعالیت می کند شخص ناظر مسئول عمل زیانبار است هر چند که او نسبت به فعل زیانبار، ثالث محسوب می شود. اما به نظر می رسد که منظور قانونگذار از مسئول شناختن شخص ثالث صرفاً جهت حمایت از زیان دیده بوده است؛ زیرا ممکن است زیان دیده با شخص ناتوان رو به رو شود و خسارت او جبران نشده باقی بماند، ولی در بعضی مواقع مسئول شناختن ثالث صرفاً از باب تقصیری است که در انجام وظیفه خود مرتکب شده است، مانند فرضی که خسارت در نتیجه کوتاهی سرپرست در حفاظت از صغیر یا مجنون وارد شده است.
در فرضی که جبران کننده خسارت می تواند به عامل زیان رجوع کند به نظر می رسد که این رجوع به عامل زیان مبتنی بر جانشینی از سوی زیان دیده است چون مدیون اصلی و واقعی عامل ورود زیان است و قانونگذار برای حمایت از زیان دیده شخص ثالثی را به دلیل رابطه حقوقی که با عامل زیان دارد مسئول جبران خسارت می داند؛ از اینرو ثالث به حکم قانون دین عامل ورود زیان را پرداخت می کند و پس از پرداخت، حقوق زیان دیده علیه عامل زیان به او منتقل می شود و بر این اساس می تواند به عامل زیان مراجعه کند.
گفتار دوم: ذینفع بودن پرداخت کننده در تأدیه دین دیگری
برای اینکه شخص پرداخت کننده جانشین زیان دیده قرار بگیرد اول باید التزام در پرداخت تعهد (محگوم به) دیگری به حکم قانون وجود داشته باشد و دوم باید پرداخت کننده در پرداخت ذین نفع باشد تا جانشینی پرداخت کننده محقق می شود، هر چند که از سوی مدیون اذن در پرداخت نداشته باشد.^[۲۹۷] با ذی نفع بودن پرداخت کننده این امر اثبات می شود که پرداخت کننده نه قصد تبرع داشته است و نه قصد فضولی لذا اعطای حق رجوع با حکم ماده۲۶۷ ق.م. مغایرت ندارد.
برای روشن شدن مطلب بالا مثالی می زنیم: شخصی به موجب سند عادی مال غیر منقول را خریداری می کند پس برای انتقال سند رسمی به نام خریدار باید فروشنده عوارض، مالیات و سایر بدهی مربوط به مال را پرداخت کند، ولی از تکلیف خود شانه خالی می کند و خریدار برای تسریع در انجام عملیات تنظیم سند بدهی های فروشنده را پرداخت می کند، در این حالت اگر خریدار را جانشین مراجع موصوف (طلبکار) ندانیم او حق رجوع به فروشنده را ندارد؛ چون از طرف فروشنده اذن نداشته است. آیا این نتیجه عادلانه خواهد بود؟ پس اگر ما نظریه جانشینی را برای خریدار قبول نداشته باشیم، خریدار نسبت به پرداخت بدهی مال غیر منقول اقدام نمی کند و ناچار باید به محاکم دادگستری برای الزام خریدار به تنظیم سند رسمی رجوع کند که این هم موجب زیان خریدار و هم موجب زیان اجتماعی و ایجاد تراکم در محاکم می شود؛ از اینرو به نظر می رسد بهترین راهکاری که می شود ارائه داد این است که خریدار را جانشین طلبکار فرض کنیم و مبلغی را که خریدار بابت بدهی مال غیر منقول پرداخت کرده است از باقیمانده ثمن کسر شود و سپس تنظیم سند رسمی انتقال انجام شود. ماده۲۴۸ قانون امور حسبی در تأیید این مطلب بیان شده است که هر یک از ورثه اداء‌ تمام دیون به نسبت سهم خود را خواهند داشت و تا زمانی که همه وراث سهم خود را از دین متوفی پرداخت نکنند ترکه قابل تقسیم نیست. اگر بعضی از ورثه دین متوفی را نسبت به سهم خود پرداخت کنند و بعضی دیگر پرداخت نکنند، تقسیم ترکه ممکن نیست ورثه ای که مایل به تقسیم ترکه باشند باید سهم ورثه را که دین متوفی را از سهم خود پرداخت نمی کنند؛ پرداخت نمایند. با پذیرش نظریه جانشینی، وراثی که سهم وراث دیگر از بدهی متوفی را پرداخت کرده اند حق رجوع دارند.
جانشینی ورثه پرداخت کننده تمام دیون متوفی را می توان با وحدت ملاک از تبصره۱ ماده۳۴ قانون ثبت به دست آورد.^[۲۹۸]هر چند تبصره ماده ۳۴ قانون ثبت مربوط به فرضی است که مال متوفی در وثیقه رسمی طلبکاران قرارداد باشد، ولی وثیقه بودن چنین خصوصیتی ندارد که حکم مزبور را مختص این فرض بدانیم پس مبنای تبصره مزبور برای حمایت از حقوق ورثه ای است که قصد دارد با پرداخت تمام دین طلبکار از صدور اجرائیه برای مال متوفی در زمان نامناسب جلوگیری کند، همچنانکه ماده ۷ آئین نامه اجرای اسناد رسمی لازم الاجراء در اصلاحیه سال ۱۳۸۷ بر این تفکر صحه گذاشته و قید در وثیقه بودن مال مورث را از شرایط قائم مقامی حذف کرده است .
رأی اصراری شماره۳- ۴/۳/۷۸ دیوان عالی کشور این نتیجه را تأیید می کند. در این رأی بیان شده است:« اگر پرداخت دین از طرف شخص ثالث غیر تبرعی و اضطراری و به منظور امکان استیفای حق بوده باشد حکم قاعده لاضرر تأدیه دین به کیفیت مذکور انطباقی با ماده۲۶۷ ق.م. ندارد.»
گاهی مواقع نفع ثالث در ایفاء محکوم به غیر مستقیم است . برای مثال محکوم علیه مالی از اموال خود را به شخصی فروخته است و محکوم له دعوایی به عنوان ابطال معامله به جهت قصد فرار از دین علیه محکوم علیه و خریدار مطرح می نماید . خریدار برای رفع ضرر بیشتر ناشی از ابطال معامله ، حاضر می شود طلب محکوم له را پرداخت نماید تا نفع او در طرح دعوای معامله به قصد فرار از دین منتفی گردد و مانع رد معامله گردد.^[۲۹۹] درست است که در این موارد ، ثالث پرداخت کننده در این پرداخت ذینفع می باشد، ولی بنظر تا این اندازه نفع مستقیم نبوده و کافی برای ایجاد جانشینی و قائم مقامی با پرداخت نمی باشد.
مبحث سوم : شرایط قائم مقامی (جانشینی ) با پرداخت
برای اینکه بتوان پرداخت ثالث غیر ماذون را مشمول جانشینی با پرداخت تلقی کرد وجود شرایطی باید احراز شود: لزوم پرداخت و وجود شرایطی در پرداخت کننده و تعهد از این موارد می باشد که در این مبحث به مطالعه آنها می پردازیم. این شرایط به طور پراکنده در موارد متعدد مذکور در فصل قبل پیش بینی شده بود، در این فصل سعی داریم آنها را به رشته نظم و قاعده در درآوریم .
گفتار اول: لزوم پرداخت
مفهوم شرط لزوم پرداخت، مبنای این شرط و استثنائات آن، مباحثی هستند که در این گفتار به آنها می پردازیم:
بند اول) مفهوم
جانشینی با پرداخت، با پرداخت دین دیگری حاصل می شود، پس پرداخت دین دیگری شرط اصلی و سازنده این نوع جانشینی است.
شرط پرداخت وجه ممیز اصلی جانشینی ناشی از پرداخت و سایر اقسام جانشینی شخص؛ یعنی جانشینی ناشی از انتقال مال و جانشینی ناشی از انتقال قرارداد است؛ زیرا در جانشینی ناشی از انتقال مال وصف جانشینی با انتقال مالکیت مال از طرف مالک به منتقل الیه محقق می شود اعم از اینکه این انتقال مال معوض یا غیر معوض باشد و اعم از اینکه در انتقال معوض، عوض پرداخته شده یا نشده باشد.
به لزوم پرداخت برای تحقق قائم مقامی در قوانین مختلف نیز تصریح شده است:
۱- ماده۶۶ قانون تأمین اجتماعی مقرر می دارد که:« درصورتیکه ثابت شود وقوع حادثه مستقیماً ناشی از عدم رعایت مقررات بهداشتی و احتیاط لازم از طرف کارفرما یا نمایندگان او بوده، سازمان تأمین خدمات درمانی و سازمان، هزینه های مربوط به معالجه و غرامات و مستمری ها و غیره را پرداخته و طبق ماده۵۰ این قانون از کارفرما مطالبه و وصول خواهد نمود.
ماده۶۶ قانون تأمین اجتماعی جانشین ماده۴۹ قانون بیمه های اجتماعی کارگران مصوب۱۳۳۹ شده است در این ماده هم بیان شده بود که: « در صورتیکه ثابت شود که وقوع حادثه یا بیماری مستقیماً ناشی از عدم رعایت مقررات بهداشتی و حفاظت فنی یا احتیاطات لازم از طرف کارفرما یا نمایندگان او بوده سازمان مکلف است هزینه های مربوط به معالجه و غرامات و مستمری ها و غیره را پرداخته و از کارفرما مطالبه و وصول کند. همچنین در صورتیکه وقوع حادثه ناشی از خطای شخص ثالثی باشد سازمان کمک های مقرر در این قانون را درباره بیمه شده انجام داده، شخص ثالث را تعقیب و هزینه های مربوطه را از او وصول خواهد کرد.» ^[۳۰۰]
اولین شرط رجوع سازمان تأمین اجتماعی پرداخت از ناحیه سازمان در حق زیان دیده یا بازماندگان واجد شرایط است تا قبل از پرداخت توسط سازمان تأمین اجتماعی، از دارایی سازمان کاسته نشده و سازمان متحمل ضرری نشده است تا دعوی مسئولیت مدنی اقامه کند و جانشینی هم در اثر پرداخت ایجاد می شود و پیش پرداخت جانشینی برای سازمان محقق نشده است.^[۳۰۱]
۲- ماده۲۷۱ ق.ت. مقرر می دارد که:«شخص ثالثی که وجه برات را پرداخته دارای تمام حقوق و وظایف دارنده برات است»
۳- ماده۳۴ قانون ثبت بیان داشته است که:« …….هر بستانکاری ….. می تواند کلیه بدهی موضوع سند به بستانکار دیگر و نیز حقوق دولت را پرداخته و یا در صندوق ثبت و یا هر مرجع دیگری که اداره ثبت تعیین می نماید تودیع و تقاضای استیفای حقوق خود را از اداره ثبت بنماید…..»
در حقوق فرانسه جانشینی یا پرداخت در فصل مربوط به پرداخت آمده است و قید «پرداخت» در تمام مواد قانونی استفاده شده است. به طور مثال (ماده۱۲۴۹ ق.م.، ماده۳۶ قانون بیمه و ماده۳۸۱ قانون گمرکی) رویه قضایی کشور فرانسه با قانون آن هماهنگ است دیوان کشور فرانسه در رأی مورخه۲۴ مارس ۱۹۹۲ در این باره مقرر می دارد:« بیمه گر تا میزان که جبران خسارت نکرده است نمی تواند از جانشینی در حقوق بیمه گذار بهره مند شود» یا در مورخه۱۴ دسامبر ۱۹۶۵ مقرر می دارد:«طرح دعوی از سوی بیمه گر علیه متصدی حمل و نقل قبل از جبران خسارت بیمه گذار قاطع مرور زمان یک ساله در ماده۱۰۸ قانون تجارت نیست اگر چه بعداً خسارت بیمه گذار را جبران کند. اگر بیمه گر در زمان طرح دعوی علیه متصدی حمل و نقل خسارت بیمه گذار را جبران نکرده باشد دعوایش مسموع نخواهد بود.
بند دوم) مبنای شرط
شرط لازم و ضروری «پرداخت» در ایجاد جانشینی با مبنای و منشأ که برای این نوع جانشینی اتخاذ گردیده است منطبق است. عنصر اصلی و اولیه جانشینی، پرداخت دین دیگری است و جانشینی اثری است که یا به موجب قانون یا توافق بین پرداخت کننده با دائن یا مدیون به منظور حمایت از پرداخت کننده غیر مدیون می باشد و هم دین و هم تضمینات و امتیازات آن دین به شخص ثالث پرداخت کننده دین دیگری منتقل می شود، بنابراین طبیعی و منطقی است که جانشینی شخص بعد از پرداخت حاصل شود و قبل از پرداخت، ثالث تکلیفی به پرداخت دین مدیون ندارد و به همین دلیل نیازی به حمایت ندارد.^[۳۰۲]
بنابراین در مواردی که قائم مقام ملزم به پرداخت یک مستمری به طلبکار است قائم مقامی و حق رجوع فقط پس از پرداخت هر مبلغ در مواعد معین ایجاد می شود. این حالت مخصوصاً در قائم مقامی سازمان تأمین اجتماعی پیش می آید بدین ترتیب که مطابق ماده۶۶ قانون تأمین اجتماعی۱۳۵۴ در صورتی که ثابت شود وقوع حادثه که منجر به فوت یا صدمه کارگر شده، ناشی از تقصیر کارفرما است، سازمان تأمین اجتماعی پس از پرداخت هزینه های مربوط به معالجه و غرامت و مستمری می تواند به کارفرما عامل زیان مراجعه کند. ملاحظه می شود که یکی از تعهدات سازمان تأمین اجتماعی در مقابل کارگر بیمه شده، پرداخت مستمری است؛ مانند مستمری ناشی از کارافتادگی یا مستمری ناشی از فوت که به بازماندگان بیمه شده پرداخت می شود (مواد۳ و۴ قانون تأمین اجتماعی)
حال با اجرای شرط لزوم پرداخت قبلی از سوی جانشینی برای رجوع به مدیون اصلی لازم است که سازمان فقط پس از پرداخت هر قسم از این مستمریها در سررسید معین، بتواند به کارفرمای عامل زیان رجوع کند^[۳۰۳]. این امر مشکلات فراوانی به دنبال خواهد داشت از یک طرف رجوع مکرر سازمان تأمین اجتماعی به کارفرما عامل زیان موجب صرف زمان و هزینه های زیادی خواهد شد از طرف دیگر ممکن است سازمان را در آینده با خطر اعسار یا ورشکستگی یا فوت کارفرما یا مسئول حادثه مواجه کند و در صورت فوت مسئول حادثه، مشکل چند برابر می شود چون در فرض فوت کارفرما سازمان پس از پرداخت مستمری به زیان دیده باید به همه وراث کارفرما به اندازه سهمشان از ما ترک رجوع کند (ماده ۲۴۸ قانون امور حسبی) البته در تبصره۱ ماده ۶۶ قانون تأمین اجتماعی تا حدی به این مشکل توجه داشته است و در تبصره۱ ماده ۶۶ بیان داشته است مقصر می تواند با پرداخت معادل ده سال مستمری موضوع این ماده به سازمان از این بابت بری الذمه شود یعنی برای جلوگیری از مشکلات ناشی از اجرای ماده۶۶ قانون تأمین اجتماعی که مبتنی بر شرط لزوم پرداخت جانشینی است، سازمان حاضر است از بخشی از حقوق خود بگذرد و مقصر حادثه را تشویق کند که با پرداخت مبلغ معادل ده سال مستمری به طور کامل در مقابل سازمان بری الذمه گردد اما اشکالی که در تبصره۱ ماده ۶۶ بیان شده است به کار بردن واژه «می تواند» این اختیار را به مدیون می دهد اگر حاضر به پرداخت این مبلغ نگردد سازمان نمی تواند او را اجبار کند در این صورت سازمان باید پس از پرداخت هر مقرری به طور جداگانه به مقصر رجوع کند.
بند سوم) استثناء ‌ شرط پرداخت در قوانین
از آنجائیکه موضوع پایان نامه پرداخت محوم به و تعهد موضوع سند اجرایی می باشد که پرداخت رکن اساسی بحث می باشد، لذا به این بحث صرفا از جهت ناقص نبودن بحث جانشینی با پرداخت اشاره می شود و لذا به اختصار از آن می گذریم
اگرچه اصولا در موارد مربوط به جانشینی قید «پرداخت» به طور صریح یا ضمنی بیان شده است ولی استثنائاتی هم وجود دارد:
۱- مثل ماده۳۰ قانون بیمه که بیان می دارد:« بیمه گر در حدودی که خسارات وارده را قبول یا پرداخت می کند در مقابل اشخاص که مسئول وقوع حادثه یا خسارت هستند جانشین بیمه گذار خواهد بود و اگر بیمه گذار اقدامی کند که منافی با عقد مزبور باشد در مقابل بیمه گر مسئول شناخته می شود.»
ما اصل را بر این دانسته بودیم که با پرداخت جانشینی شخص ثالث محقق می شود، ولی در ماده۳۰ قانون بیمه (قبول) را کافی دانسته است اگر چه پرداخت انجام شده باشد یا پرداخت انجام نشده باشد، پس این ماده استثنایی است که به «پرداخت» وارد شده است.^[۳۰۴]
۲- در ماده۳۱۸ قانون مدنی بیان شده است که:« هر گاه مالک رجوع کند به غاصبی که مال مغضوب در ید او تلف شده است، آن شخص حق رجوع به غاصب دیگر ندارد؛ ولی اگر به غاصب دیگری به غیر آن کسی که مال در ید او تلف شده است رجوع نماید، مشارالیه نیز می تواند به کسی که مال در ید او تلف شده است رجوع کند و یا به یکی از لاحقین خود رجوع کند تا منتهی شود به کسی که مال در ید او تلف شده است و به طور کلی ضمان به عهده کسی مستقر است که مال مغضوب در نزد او تلف شده است.»
در این ماده بیان کرده است که «رجوع» مالک به غاصبی که مال در ید او تلف نشده است را کافی برای رجوع غاصب مزبور به سایر غاصبین قرار داده است هر چند که آن غاصب پرداخت را انجام نداده است مگر اینکه اینطور توجیه کنیم مقصود قانونگذار این بوده که بعد از پرداخت غاصب حق رجوع به غاصبی که مال در دست او تلف شده را دارد.^[۳۰۵]
بند چهارم) نحوه پرداخت
اگر پرداخت قبلی را شرط تحقق جانشینی بدانیم شیوه پرداخت اهمیت چندانی ندارد و منظور از پرداخت یعنی اجرا یا انجام تعهد دیگری اعم از اینکه موضوع تعهد وجه نقد باشد یا تسلیم مال کلی. در جانشینی با پرداخت آنچه با اهمیت است سقوط تعهد یا برائت ذمه مدیون در مقابل طلبکار به وسیله جانشین است
جانشینی نه تنها می تواند با ایفاء دین (بند یک ماده۲۶۴ ق.م.) مانند تأدیه وجه نقد یا تسلیم مال موضوع تعهد برای مدیون برائت ذمه بگیرد، بلکه می تواند با سایر اسباب سقوط تعهدات نیز این نتیجه را بدست‌ آورد؛ به طور مثال اگر جانشین از طلبکار مدیون قبلاً طلبکار بوده باشد، با فراهم بودن شرایط تهاتر، تعهد مدیون ساقط می شود و جانشینی می تواند به مدیون اصلی مراجعه کند و یا جانشینی می تواند طلب طلبکار را حواله دهد، لذا جانشین می تواند به مدیون مراجعه کند؛ چون طبق ماده۷۱۰ ق.م. حواله نیز نوعی پرداخت محسوب می شود.
سایر اسباب سقوط تعهدات در جانشینی امکان پذیر نیست؛ به طور مثال در اقاله در صورتی می تواند اقاله کرد که دو طرف عقد توافق نمایند در حالی که جانشین یکی از طرفین عقد محسوب نمی شود تا بتواند اقاله صورت بگیرد؛ چون همانگونه که قبلاً بیان کردیم جانشینی با پرداخت حاصل می شود در حالیکه در ابراء، تبدیل تعهد، مالکیت مافی الذمه جانشین قبل از پرداخت تعهد مدیون را به عهده نمی گیرد، پس قائم مقامی در آن امکان پذیر نیست؛ چون اگر شخصی در مقابل طلبکار تعهد به پرداخت دین دیگری می کند عمل او ضمان است و تابع این عقد محسوب می شود؛ چون بین عقد ضمان و قائم مقامی تفاوتهایی وجود دارد. چون در عقد ضمان با تحقق عقد، ضامن دین مضمون عنه را به ذمه می گیرد و برائت ذمه مضمون عنه با تعهد ضامن ساقط می شود. (ماده ۶۹۸ ق.م.) در حالی که در جانشینی با پرداخت، قبل از پرداخت توسط جانشین هیچ تعهدی را به عهده نگرفته است پس حق رجوع به مدیون اصلی را ندارد و فقط با پرداخت جانشینی حاصل می شود.
آنچه که اهمیت دارد این است که اگر جانشین برای پرداخت از اسناد تجاری استفاده کند تا زمانی که وجه این اسناد از طرف طلبکار وصول نشود جانشینی محقق نمی شود؛ چون اسناد تجاری خاصیت ابرائی ندارد و تا وقتی که وصول نشود تعهد صادر کننده به قوت خود باقی است.
گفتار دوم : شرایط پرداخت کننده یا عامل پرداخت

رویکرد مگی بر دیدگاه رفتاری ( تکرار خرید^[۴۰] ) و نگرشی تأکید دارد؛ رویکرد الماس وفاداری بر علامت تجاری تأکید کلی دارد و مقولات متعهد بودن به علامت تجاری و پشتیبانی از آن را شامل می شود که شباهت زیادی به رویکرد مگی دارد. رویکرد چهارc در وفاداری هم بر اساس مطالعات دیک و باسو می باشد که شباهت فراوانی به رویکرد مگی دارد، از اینرو فقط به رویکرد مگی به پرداخته می شود.
رویکرد مگی : در زمینه اندازه گیری وفاداری مشتریان دو مبنای معمول وفاداری وجود دارد. یکی از این دیدگاه ها بر اساس مفهوم رفتاری است و به تکرار رفتار خرید مشتری می پردازد. در این دیدگاه، سه معیار« نسبت خرید، توالی خرید و احتمال آن» مطرح می شود. برای ارزیابی این ابعاد وفاداری می بایست داده های مربوط به گذشته خرید مشتریان تخمین زده شود.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

دیدگاه دوم که دیدگاه نگرشی خوانده می شود، ساختار های دانش، احساسی و ذهنی مشتریان را به هم مرتبط می کند و در آن اثرات برنامه ریزی شده و هدف گذاری شده رفتار مشتری به عنوان متغییر واسطه بین محرک و پاسخ اندازه گیری می شود. مگی این دو دیدگاه را در آمیخته و چهار نوع وفاداری را به صورت جدول ۲-۲ از هم متمایز کرده است ( شاهین و تیموری، ۱۳۸۷).
وفاداری واقعی : وفاداری واقعی زمانی وجود دارد که مشتریان به طور منظم از سازمان خاصی به خاطر ترجیحات قوی خود خرید نمایند. در نتیجه این طبقه سود آورترین طبقه وفاداری است. مدیران می بایست بر حفظ و تقویت نگرش های مشتریان تمرکز کرده، مزیتهای قیمتی خود را نگه داشته و خدمات دیگری را که از نظر مشتری ارزشمند است، نیز ارائه دهند.
وفاداری پنهان : مشتریان وفادار پنهان، براساس نگرش بالای خود نسبت به سازمان و علامت تجاری آن مشخص می شوند، اما رفتار خرید آنها مشخص نیست. انتخاب های صورت گرفته توسط این دسته از مشتریان معمولاً تحت تأثیر محل عرضه کننده، وضعیت موجودی کالا یا تأثیرات پذیرفته شده از دیگران قرار می گیرد. در چنین موقعیتی مدیران می بایست موانع رفتاری تکرار خرید را از میان بردارند.
وفاداری جعلی : وفاداری جعلی به دلیل اینکه مشتری معتقد نیست که گزینه های موجود متنوع است، شباهت بسیاری به مفهوم عدم فعالیت و بی علاقگی دارد. در اینجا الگوی تکرار خرید، مبتنی بر پیشنهادات خاص، راحتی، دسترسی به واسطه ها و توصیه دیگران می باشد. در نتیجه مشتریان ممکن است تنها به طور گاه گاه وفادار باشند و به راحتی به سازمان را با رقیبان عوض کنند. در اینجا هدف مدیران می بایست اثر گذاری بر مشتریان جهت تبدیل آنها به مشتریان وفادار باشند که این مهم از طریق تأثیر گذاری بر نگرش آنها نسبت به علامت تجاری سازمان صورت گیرد.
عدم وفاداری : در موقعیت هایی که نگرش نسبی مشتری و نیز تکرار خرید مشتری در سطح پائینی باشد عدم وفاداری وجود دارد. مشتریان این طبقه بر اساس راحتی خود و نه وفاداری، به خرید مبادرت می کنند. در این مورد سازمانها نباید هیچگونه منابع غیر ضروری را برای چنین مشتریانی صرف کنند. با این حال اگر این مشتریان پتانسیل تبدیل شدن به مشتریان وفادار آینده باشند، سازمانها باید برای تأ ثیر گذاری بر رفتار و نگرش آنها تلاش نمایند.

جدول ۲-۴- انواع وفاداری از دید گاه (مگی، ۱۹۹۹؛ دیک و باسو، ۱۹۹۴)
۲-۳-۹- عوامل مؤثر بر وفاداری
شرکتها به منظور کسب رضایت مشتریان وفادار لازم است از انتظارات آنها فراتر روند؛ در غیر این صورت ممکن است مشتریان به عرضه کننده دیگری متمایل شده و احتمالاً بر اساس کیفیت محصولات و خدمات که از رقبا دریافت کرده اند، بتوانند باعث تغییر نظر دیگر مشتریان گردند. با همه اینها، فراتر رفتن انتظارات مشتری نشان دهنده تمام ابعاد وفاداری نمی باشد. برخی از این عوامل مؤثر بر وفاداری را استون و جکوبز به شرح زیر فهرست کرده اند(استون و جکوبز، ۲۰۰۰)^[۴۱].
تحویل درست و به موقع
داشتن موجودی در انبار
دقت صورت حسابها
اطلاعاتی که برای مشتری یا مشتریان مشتری مشتری تان تأمین می کنید.
پاسخ دهی به درخواستها و سوالات
پشتیبانی ادراکی مؤثر
۲-۳-۱۰- مزایای وفادار سازی مشتری
صاحب نظران دانش بازاریابی مزایای زیادی برای وفاداری شمرده که برخی از بارزترین آنها عبارتند از:
کاهش هزینه های جذب مشتریان جدید؛
کاهش حساسیت مشتریان به تغییرات و قیمت ها؛
منافع حاصل از ارزش طول مشتری

یمین فیروز، موسی(۱۳۸۳)، دانش ومدیریت دانش در سازمان ها، فصلنامه کتاب، شماره ۵۳،: ۹۷،۱۰۸٫
معماری استراتژیک(۱۳۸۹)،مدل های ارزیابی عملکرد.دسترسی در تاریخ:۱۳۹۱/۰۵/۲۵:
http://strategymehvar.blogfa.com/post-41.aspx
یارمحمدیان،م.ح ،بهرامی،س ،کریمیان،ج ، شهرزادی،ل و مصدق راد،ع.م(۱۳۸۷)، مقایسه ی چهار مدل مدیریت عملکرد در سیستم بهداشت و درمان، مجله مدیریت اطلاعات بهداشت و درمان،ص۷۱-۷۸٫
کاستلز مانوئل: عصر اطلاعات (اقتصاد، جامعه و فرهنگ)، مترجمان احمد علیقلیان، افشین خاکباز، انتشارات طرح نو، جلد ۱، ۱۳۸۴٫
اعرابی، م و شیرخانی، ف(۱۳۸۸)، تدوین استراتژی های مناسب مالیاتی بر اساس مدل SWOT در اداره مالیات بر کالا و خدمات، پژوهشگر (مدیریت) تابستان; ۶(۱۴)، ص: ۱۲، ۲۴
احمدی، ع و درویش، ح (۱۳۸۹)، مبانی کارآفرینی، تهران: دانشگاه پیام نور، ص: ۴٫
اسدی، ع و چوبچیان، ش و شعبانعلی فمی، ح(۱۳۸۸). آشنایی با شیوه های خود اشتغالی، تهران: دانشگاه پیام نور، ص: ۱۷۸٫
اسماعیل پور، م (۱۳۸۶)، نگاهی کوتاه بر برنامه ریزی استراتژیک، فرهنگ و تعاون، شماره ۵۱٫ص:۲۲- ۲۶
ایمان خان،ن(۱۳۸۸)، بررسی استراتژی های رقابتی شرکت های صادرکننده برتر ایرانی در سال ، فصلنامه مدیریت،ص:۶۹-۷۹٫
بنیاد توانمند سازی منابع انسانی ایران(۱۳۹۰)، توانمند سازی نیروی انسانی، دسترسی در تاریخ: ۱۳۹۱/۰۴/۰۱ http://www.iran-
حقیقی، م(۱۳۸۴)، برنامه ریزی استراتژیک و جایگاه آن در سازمان های صنعتی و تجاری ایران، دانش مدیریت،شماره ۲۹-۳۰٫ص:۱۱، ۱۳٫
حاجیها، ز و چناری بوکت، ح(۱۳۹۲)، مطالعه تاثیر انگیزه مدیران ارشد بر خلق ثروت (ارزش آفرینی) برای سهامداران، فصلنامه علمی پژوهشی دانش سرمایه گذاری، سال دوم،صص:۸۱-۹۸٫

( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

حسینی، س م، (۱۳۸۰)، “مدیریت استراتژیک‌"، تهران-انتشارات دانشگاه شهید بهشتی، ص: ۳۳٫
خلیل پور، س م (۱۳۷۷)، روش شناسی مطالعات استراتژیک، شماره ۱۵ و ۱۶، ص:۶۳٫
داوری، د (۱۳۸۲)، مدیریت استراتژیک از تئوری تا عمل، نشر: دلسا، ص: ۹، ۱۱، ۱۳
کوبین، ج و مینتزبرگ، ه و جیمز، ر (۱۳۷۳)، مدیریت استراتژیک: فرایند استرتژی، ترجمه محمد صائبی، تهران: مرکز آموزش مدیریت دولتی، ص: ۴۳٫
مدرکیان، ح (۱۳۸۶)، استراتژی برنامه ریزی در جمهوری اسلامی ایران، نشریه مدیریت، شماره ۱۲۱ و ۱۲۲، ص:۸٫
منابع لاتین
Deshpande,R., Grinstein,A., Kim,S., Ofek,E(2013), Achievement motivation, strategic orientations and business performance in entrepreneurial firms, International Marketing Review Vol. 30 No. 3,pp. 231-252.
Noble, C.H., Sinha, R.K. and Kumar, A. (2002), “Market orientation and strategic orientations: a longitudinal assessment of performance implications”, Journal of Marketing, Vol. 66 No. 4, pp. 25-39.
Zott, C., Dynamic capabilities and the emergence of intraindustry differential firm performance. Strat. Mgmt J., 2008, 24, 97–۱۲۵٫
Ferraresi,A., Quandt,C,O., dos Santos,S., Frega,J(2012), Knowledge management and strategic orientation: leveraging innovativeness and performance, JOURNAL OF KNOWLEDGE MANAGEMENT, VOL. 16 NO. 5 2012, pp. 688-701
Yang,Y., Zhu,H., Wu, G(2009), Untangling the strategic orientation and its impact on product innovation performance: An empirical study on the Chinese enterprises, Research Center for Technological Innovation, Tsinghua University, 100084
Borghini S(2005).Organizational_creativity:_Breaking_equilibrium_and_order_to innovate. Journal of_Knowledge_ Management; 9(4): 19–۳۳٫
Choi B, Poon S, Davis J.(2008), Effects_ of_ knowledge_management_ strategy on organization_ _ performance:_ Acomplementarity_theory-based_approach. Omega; 36(2): 235–۲۵۱٫
Deshpande,R., Grinstein,A., Kim,S., Ofek,E(2013), Achievement motivation, strategic orientations and business performance in entrepreneurial firms, International Marketing Review Vol. 30 No. 3,pp. 231-252.
-Steensma, H.K., Marino, L., Weaver, M.K. and Dickson, P.H. (2000), “The influence of national culture on the formation of technology alliances by entrepreneurial firms”, Academy of Management Journal, Vol. 43 No. 5, pp. 951-973.
Knight, G. (2000), “Entrepreneurship and marketing strategy: the SME under globalization.”, Journal of International Marketing, Vol. 8 No. 2, pp.
Timmers, P. (2000), “Electronic commerce: Strategies and models for business-tobusiness trading", Somerset, NJ: John Wiley & Sons, Inc.
Yang,Y., Zhu,H., Wu, G(2009), Untangling the strategic orientation and its impact on product innovation performance: An empirical study on the Chinese enterprises, Research Center for Technological Innovation, Tsinghua University, 100084
Bernardin, H.J. (2003). Human Resource Management: an experiential approach. 3 th Edition. New York: Mc GrawHill.
Kaplan, R.S. and Norton, D.P. (1992), “The Balanced scorecard: Measures that Drive performance", Harvard Business Review, January-February, pp.71-9
Li, p. (2001), “Design of performance Measurement systems: a stakeholder Analysis Framework", The Academy of Management Review. Mississippi State, Apri GREENBERG, J & BARON, R.A(2000) “BEHAVIOER IN ORGANIZATIONS”, PRENTIC-HALL, INC, 7th ed,
Nabitz,U and Klazinga,N(2000),The EFQM excellence model:Europe and Dutch experiences with the Efqm approach in health care.Europe Foundation for Quality Management,int Qual Health Care :p.191.
Noe, R.A, Hollenbeck, J. R, Gerhurt, B & Wright, P.M. (2008). Human Resource Management: gaining Competitive advantage. New York: Mc GrawHill.
Snell, S. A & Bohlander, G. W. (2007). Managing Human Resources. Thomson Publishing Company.
Bell,D.(1978),The cultural Contradiction of Capitalism,Heinemann.London.
Davenport, T, and Prusak L.(1998), Working Knowledge:Hoe Organizations Manage What They Know, Harvard Bussiness School Press, Boston Massachusetts.
Quinn,J.(1992), Intelligent Enterprise: A know,and servise based paradigm for Industry.The .free press,New york,NY,
Reitz, J.M(2004),Odlis:on line Dictionary of Library and Information Science. Libraries Unlimitted.available at:lu.com/odlis.
Zott, C., Dynamic capabilities and the emergence of intraindustry differential firm performance. Strat. Mgmt J., 2008, 24, 97–۱۲۵٫
Zollo, M. and Winter, S.G., 2007, Deliberate learning and the evolution of dynamiccapabilities. Organ. Sci., 13, 339–۳۵۱٫
Venkatraman, N., The concept of fit in strategy research: toward verbal and statistical correspondence. Acad. Mgmt Rev., 2009, 14(3), 423–۴۴۴٫
Teece, D.J., Capturing value from knowledge assets: the new economy, markets for know-how, and intangible assets. Calif. Mgmt Rev., 2008, 40(3), 55–۷۹٫
Smith, K., Interactions in knowledge system: foundations policy implications and empirical methods. STI Rev., 2005, 16, 69–۱۰۲٫
Slater, S.F. and Narver, J.C., Market orientation and the learning organization. J. Market., 2005, 59(3), 63–۷۴٫
Baker, W.E. and Sinkula, J.M., Learning orientation, market orientation and innovation: integrating and extending models of organizational performance. J. Market Focused Mgmt, 2009, 4, 295–۳۰۸٫
Davenport, T.H. and Prusak, L., Working Knowledge: How Organizations Manage What They Know, 2008 (Harvard Business School Press: Boston).

۱۹- ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
۳-۴-۵ تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید - AMP⁺ pBSK که حاوی ژن C2 پروتئین ALCAM سنتز شده توسط کمپانی می باشد، با توجه به جایگاههای آنزیمی در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهای ژن سنتز شده می توان از آن ها جهت تایید حضور ژن در پلاسمید استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه ^[۴۹] جهت بررسی بر روی ژل آگارز برده تا قطعات مورد نظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
۳-۴-۵-۱ هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion
با توجه به سازه ی طراحی شده از دو آنزیم محدود کننده ی Nco1 و XhoI جهت تایید آنزیمی استفاده شد. مراحل انجام کار به شکل زیر است:
۱- ابتدا باید بافر مناسب برای هضم دوگانه آنزیم های NcoI و XhoI را انتخاب کنیم که این کار را با کمک سایت شرکت تولید کننده آنزیم ها یعنی فرمنتاز لیتوانی انتخاب می کنیم . بهترین شرایط بافری برای این واکنش بافرx2 تانگو می باشد .

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۲- یک میکروتیوب ۲/۰ برمی داریم و محتویات واکنش که توسط سایت فرمانتاز انتخاب کردیم را به صورت زیر در آن مخلوط می کنیم .
آب استریل: ۱۲ میکرولیتر
بافر تنگو x2 : 4 میکرولیتر
آنزیم NcoI : 1 میکرولیتر
آنزیم XhoI : 1 میکرولیتر
پلاسمید : ۲ میکرولیتر
حجم نهایی واکنش:۲۰ میکرولیتر
۳- میکروتیوب را به مدت ۱ الی۲ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد ( دمای اپمتیموم واکنش آنزیم ها ) قرار می دهیم .
۳-۴-۵-۲ الکتروفورز
جهت جداسازی قطعات حاصل از هضم دو گانه آنزیمی از الکتروفورز استفاده می شود.
۳-۴-۵-۲-۱ تهیه بافر ۵۰x TAE
برای تهیه بافر TAE 50x از موارد زیر استفاده می بریم:
Tris : 5/60 گرم
EDTA 5/0 مولار ( در ۸ PH = ) : 25 میلی لیتر
اسید استیک: ۲۸/۱۴ میلی لیتر
آب استریل: به مقداری که حجم نهایی به ۲۵۰ میلی لیتر برسد.
حجم نهایی:۲۵۰ میلی لیتر
نکته: برای اینکه بافر ۵۰x TAE را به بافر TAE 1x مورد استفاده دربیاوریم آن را در حجم مناسب رقیق می کنیم .
۳-۴-۵-۲-۲ تهیه ژل آگارز
برای جداسازی قطعات حاصل از هضم دوگانه آنزیمی از ژل آگارز Low استفاده می کنیم . برای تهیه ی ژل ۱٫۵ درصد آگارز، ۰٫۴۵ گرم آگارز را در ۳۰ میلی لیتر از بافر TAE 1x حل می کنیم و با چرخاندن آرام ارلن به خوبی آن را مخلوط می کنیم . به مدت مناسب به کمک یک گرماساز آن را حرارت می دهیم تا کاملا ذوب شود. این عمل تا آستانه جوشیدن ژل ادامه می یابد ولی نباید به مرحله جوشیدن برسد. باید دقت شود که ژل به طور کامل حل شده و محلول کاملا شفاف شود.
پس از این که محلول آگارز به طور نسبی تا دمای ۵۰ تا ۶۰ درجه سرد شد(زمانی که دست را نسوزاند) ، رنگ گرین ویوئر^[۵۰]یا اتیدیوم برماید را به میزان ۲ میکرولیتر به آن اضافه می کنیم و به ظرف مناسب شانه دار منتقل می کنیم و در دمای محیط قرار می دهیم تا ژل سفت شود و ببندد(تقریبا ۱۵ دقیقه) . این ژل در حضور بافر TAE 1x تا یک هفته در دمای ۴ درجه قابل نگه داری است.
۳-۴-۵-۲-۳ Run کردن نمونه
پس از بسته شدن کامل ژل، آن را درون تانک قرار می دهیم به نحوی که چاهک ها به سمت قطب منفی قرار گیرند . تانک الکتروفورز را با بافر TAE 1x پر می کنیم تا حدی باشد که به طور کامل روی ژل را بپوشاند.
نمونه را با ۲میکرولیتر (loading dye) مخلوط کرده و در درون چاهک ریخته ومقدار ۲میکرولیتر از یک مارکر با وزن مولکولی kb 1 هم جهت شناسایی سایز قطعات در یکی از چاهک ها استفاده می کنیم .
تانک الکتروفورز را به منبع تولید ولتاژ وصل کرده و با ولتاژ ۱۲۰ ولت و ۵۵ آمپر الکتروفورز را انجام می دهیم .
وقتی رنگ تا حدود ۳/۲ ژل پیشرفت کرد تانک را از منبع نیرو جدا کرده و ژل را به کمک دستگاه Gel) (documentation مورد بررسی قرار می دهیم .
۳-۵ ساب کلونینگ ژن ناحیهC2 پروتئینALCAM
جهت بیان ژن ناحیهC2 پروتئین ALCAM از باکتری E.coli BL21(DE3) استفاده شد . ابتدا ژن مورد نظر از روی ژل اگارز مرحله الکتروفورز با بهره گرفتن از کیت خالص سازی شد و سپس به کمک تکنیک Ligation با پلاسمید pet-28a ترکیب شد . سپس این ترکیب به سلول های شایسته ی E.Coli BL21 ترانسفورم شد.
۳-۵-۱ تخلیص DNA ناحیهC2 پروتئین ALCAMاز ژل
برای تخلیص از کیت استخراج DNA از ژل تولیدی شرکت فرمنتاز لیتوانی استفاده شد. (شکل ۳-۱۱ )
شکل ۳-۱۱٫ کیت استخراج DNA از ژل فرمنتاز
روش انجام آن بصورت زیر می باشد:
۱- به کمک یک اسکالپل استریل، ناحیه ای از ژل که DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM در آن قرار دارد را جدا کرده و به قطعات کوچک تقسیم می کنیم برای راحت ذوب شدن ژل .
۲- به ژل حاوی DNA نوترکیب ، ۴۰۰ میکرولیتر Binding Buffer در داخل یک میکروتیوب اضافه می کنیم.
۳- مخلوط را به داخل بن ماری ۵۵ درجه انتقال داده و به مدت ۵ دقیقه انکوبه می کنیم برای سهولت در ذوب شدن کامل ژل آن را هر ۲ دقیقه هم می زنیم .
۴- ۵ میکرولیتر سیلیکا به مخلوط اضافه می کنیم .
۵- ۵ دقیقه در بن ماری ۵۵ درجه قرار می دهیم تا سیلیکا به خوبی حل شود.
۶- به مدت ۱۰ ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده تا سیلیکا رسوب کند . محلول رویی را دور می ریزیم.
۷- ۵۰۰ میکرولیتر washing buffer به میکروتیوب اضافه کرده و به کمک ورتکس به خوبی مخلوط می کنیم.
۸- به مدت ۱۰ ثانیه میکروتیوب را سانتریفیوژ کرده و محلول رویی را دور می ریزیم.
۹- مرحله ی ۷ و ۸ را دوبار دیگر تکرار می کنیم تا تمام الکل موجود از مرحله ی قبل حذف شود ( الکل ممکن است از واکنش های آنزیمی مراحل بعدی جلوگیری کند).
۱۰- ۳۰ میکرولیتر بافر TE به رسوب اضافه کرده و ورتکس می کنیم تا کاملا با محتویات میکروتیوب مخلوط شود .
۱۱- میکروتیوب را به مدت ۵ دقیقه در ۵۵ درجه قرار می دهیم.